Kiến thức

Một số phương pháp miễn dịch sử dụng trong phòng xét nghiệm hóa sinh

Bạn đang xem: Một số phương pháp miễn dịch sử dụng trong phòng xét nghiệm hóa sinh

Một số phương pháp miễn dịch sử dụng trong phòng xét nghiệm hóa sinh

Xét nghiệm miễn dịch là xét nghiệm dựa trên phản ứng kết hợp giữa KN và KT để tạo nên phức hợp KN-KT. Thông qua việc xác định lượng phức hợp miễn dịch tạo thành sau phản ứng để tính ra nồng độ chất cần đo

I. Bản chất của xét nghiệm miễn dịch:

Xét nghiệm miễn dịch là xét nghiệm dựa trên phản ứng kết hợp giữa KN và KT để tạo nên phức hợp KN-KT. Thông qua việc xác định lượng phức hợp miễn dịch tạo thành sau phản ứng để tính ra nồng độ chất cần đo

Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt của kháng nguyên và kháng thể. Sự kết hợp này xảy ra giữa một phần rất giới hạn giữa phân tử kháng nguyên (nhóm quyết định kháng nguyên) và một phần rất giới hạn của phân tử kháng thể (trung tâm hoạt động).

Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể rất đặc hiệu. Một kháng nguyên chỉ kết hợp với kháng thể do nó kích thích cơ thể tạo thành. Do đó phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể được sử dụng để xác định kháng nguyên hoặc kháng thể nếu một trong hai phân tử đã biết. Hiệu giá của kháng thể ở trong huyết thanh người hoặc động vật có thể xác định nhờ kháng nguyên đã biết và do đó cho biết sự tiếp xúc trước đó với kháng nguyên. Ngược lại nhờ kháng thể đã biết những kháng nguyên khác nhau của một vi sinh vật có thể nhận diện. Mặt khác sự hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép chọn lựa thích đáng vi sinh vật dùng làm vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm trùng.

Thông thường kháng nguyên và kháng thể ở dạng hòa tan. Việc nhận diện phức hợp KN-KT thông qua phản ứng ngưng kết hay sử dụng các chất đánh dấu khác nhau sẽ tạo ra các phương pháp miễn dịch khác nhau trong phòng xét nghiệm như: Miễn dịch đo độ đục, miễn dịch ELISA, miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch hóa phát quang, miễn dịch phóng xạ….

Hiện nay tại đơn vị Hóa sinh – trung tâm xét nghiệm bệnh viên đa khoa tỉnh Phú Thọ thường sử dụng 3 phương pháp sau:

– Miễn dịch đo độ đục

– Miễn dịch hóa phát quang

– Miễn dịch điện hóa phát quang

II. Các phương pháp miễn dịch sử dụng tại đơn vị Hóa sinh

1. Phương pháp miễn dịch đo độ đục:

1.1. Nguyên lý:

Dựa trên nguyên lý kháng nguyên kết hợp với kháng thể tạo thành phức hợp miễn dịch kháng nguyên – kháng thể kết tủa làm thay đổi độ đục của dung dịch. Đo độ đục của dung dịch ở bước sóng xác định. Sự tăng độ hấp thụ quang tỷ lệ với nồng độ chất cần đo.

1.2. Phân loại:

1.2.1. Phản ứng định tính 

Được thực hiện với huyết thanh pha loãng hoặc không pha loãng. Kháng thể và kháng nguyên được trộn với nhau và quan sát kết tủa tạo thành. Cũng có thể cho kháng thể vào một ống nghiệm nhỏ rồi sau đó cho kháng nguyên dần dần vào theo thành ống. Một vòng kết tủa được quan sát ở mặt phẳng phân cách. 

1.2.2. Phản ứng định lượng 

Cho phép xác định lượng kháng thể kết tủa với một lượng kháng nguyên đã biết. Cho một lượng huyết thanh vào dung dịch phản ứng để tạo phức hợp KN-KT và định lượng bằng phương pháp đo độ đục để xác định lượng kháng thể (kháng nguyên) đã phản ứng có trong mẫu thử.

1.3. Ứng dụng:

Định lượng các chất có trọng lượng phân tử không quá nhỏ như: CRP, IgA, IgG, IgM, Microalbumine, Pre-albumin….

2. Phương pháp hóa phát quang miễn dịch:

2.1. Nguyên lý: 

Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang (Chemiluminescent Immuno Assay: CLIA) dựa trên nguyên lý kháng nguyên (chất có trong mẫu bệnh phẩm) kết hợp với kháng thể (chất có trong thuốc thử) có  gắn chất đánh dấu (thường là phân tử Acridinium Ester) Nhờ chất đánh dấu có khả năng phát quang khi thay đổi pH của dung dịch phản ứng và tín hiệu phát quang được khuếch đại qua một ống nhân quang mà người ta có thể định lượng các chất có nồng độ rất thấp hoặc các chất bất thường trong cơ thể với độ chính xác rất cao so với các kỹ thuật hóa sinh thông thường khác. Phân tử Acridinium ester có trong lượng phân tử nhỏ hơn rất nhiều so với các enzyme trong phản ứng ELISA do đó tăng khả năng thâm nhập vào cơ chất và giảm thiểu hiệu ứng che lấp trung tâm hoạt động của KN và KT do đó độ chính xác tăng đáng kể so với phương pháp ELISA (đặc biệt khi định lượng những chất có nồng độ thấp)

 2.2. Ứng dụng:

Hiện nay, xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang đã được thực tế và công nghệ chứng minh là kết quả xét nghiệm chính xác hơn, dải đo rộng không cần pha loãng mẫu và nhạy hơn các phương pháp ELISA, EIA, FEIA đo màu thông thường và không cần ủ lâu. Các CLIA Kits được thiết kế để phát ánh sáng dựa trên phản ứng hóa phát quang. Các bộ xét nghiệm CLIA có một phạm vi hoạt động xét nghiệm rộng hơn, độ nhạy cao và nhanh hơn so với các phương pháp ELISA

Các xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang đã được sử dụng để phân tích nhiều hợp chất có tầm quan trọng như dược phẩm, hormon và các marker sinh học khác

 

3. Phương pháp điện hóa phát quang:

3.1. Nguyên lý:

 Kỹ thuật điện hóa phát quang (ECL: Electrode Chemi Luminescence) sử dụng chất đánh dấu Ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học, vì vậy có khả năng phát hiện chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh.

Công nghệ ECLIA là kỹ thuật hiện đại sử dụng chất đánh dấu là Ruthenium(II)-tris(bipyrrydyl) [Ru(bys)32+] và Tripopylamine (TPA). Khi phức hợp kháng nguyên – kháng thể có gắn chất đánh dấu được gắn lên bề mặt điện cực thì quá trình khởi động điện bắt đầu. Dưới tác dụng của dòng điện có điện áp 2V, hợp chất phát ra photon ánh sáng và giải phóng electron quay trở lại bám trên bề mặt điện cực (Điều này là cơ sở để giải thích tại sao khi vận hành máy phân tích cứ mỗi 2 tuần lại phải rửa điện cực bằng dung dịch rửa với qui trình dành riêng. Việc làm này nhằm loại bỏ các electron bám trên bề mặt điện cực làm

cản trở hoạt động của điện cực). Cường độ ánh sáng tỷ lệ với nồng độ chất cần phân tích và là cơ sở cho việc tính toán nồng độ chất cần đo. ECLIA đã khắc phục nhược điểm của hóa phát quang (Chemiluminescence) bằng cách sử dụng dòng điện để dễ dàng chuyển phân tử Ruthenium sang trạng thái kích thích do mất electron, ở trạng thái này phân tử Ruthenium phát quang.Do đó điện hóa phát quang có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn hóa phát quang. Đặc biệt với nguyên lý cạnh tranh khi sử dụng chất đánh dấu gắn lên chất cần đo ( Kháng thể đơn dòng ) đã giúp cho kết quả xét nghiệm sử dụng công nghệ ECLIA có độ chính xác và tin cậy rất cao.

3.2. Phân loại:

Miễn dịch điện hóa phát quang  sử dụng 3 loại nguyên lý như sau:

3.2.1. Nguyên lý Sandwich

– Đầu tiên Kháng thể gắn Biotin được cho vào để tác dụng với kháng nguyên (Chất cần định lượng) có trong mẫu bệnh phẩm tạo phức hợp KN-KT*

– Giai đoạn 2: Cho tiếp kháng thể gắn chất phát quang Ruthenium vào để tạo phức hợp *KT-KN-KT*

– Giai đoạn 3: Cho vi hạt Streptavidin là một chất có ái lực rất lớn với Biotin vào phản ứng. Ngay lập tức nó sẽ gắn vào Biotin tạo phức *KT-KN-KT**

– Sau đó toàn bộ phức hợp được đưa vào buồng đo. Tại đây vi hạt Streptavidin sẽ được bắt giữ với pha rắn trên thành buồng đo nhờ lực hút tĩnh điện.

– Giai đoạn 4: Cho dung dịch rửa vào rửa sạch tất cả các chất không được bắt giữ. Trong buồng đo chỉ còn phức hợp *KT-KN-KT**. Lúc này cho điện áp vào điện cực thì Ruthenium sẽ phát quang và được đo qua hệ thống ống nhân quang. Cường độ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ chất cần đo. Do sử dụng công nghệ khếch đại ánh sáng nên phép đo có độ chính xác rất cao

3.2.2. Nguyên lý cạnh tranh

– Đầu tiên Kháng thể gắn chất phát quang được cho vào để tác dụng với kháng nguyên (Chất cần định lượng) có trong mẫu bệnh phẩm tạo phức hợp KN-KT*

– Giai đoạn 2: Thêm KN gắn Biotin vào để tạo phức hợp *KN-KT*

– Giai đoạn 3: Cho vi hạt Streptavidin vào phản ứng tạo phức **KN-KT*

– Sau đó toàn bộ phức hợp đi vào buồng đo. Tại đây phức **KN-KT* được bắt giữ

– Giai đoạn 4: Cho dung dịch rửa vào rửa sạch tất cả các chất không được bắt giữ. Trong buồng đo chỉ còn phức hợp **KN-KT* . Lúc này cho điện áp vào điện cực thì Ruthenium sẽ phát quang. Cường độ ánh sáng tỷ lệ nghịch với nồng độ chất cần đo do đó nếu nồng độ càng nhỏ thì cường độ ánh sáng càng lớn. Đây là ưu điểm vượt trội của phương pháp cạnh tranh

3.2.3. Nguyên lý bắc cầu

Tương tự nguyên lý Sandwich nhưng khác biệt ở chỗ kháng thể đánh dấu có thể tạo liên kết với phức hợp KN-KT* bên cạnh vì có nhiều vị trí tạo liên kết do đó tạo thành phức hợp KN-KT lớn dễ dàng cho việc đo cường độ ánh sáng phát quang. Tuy nhiên do sử dụng KT đa dòng nên tính đặc hiệu sẽ giảm. Thường dùng để định lượng kháng thể.

3.3. Ứng dụng:

– Nguyên lý cạnh tranh: dùng cho việc phân tích những chất có kích thước vô cùng nhỏ như: FT3, FT4, Cortisol, Testosterone, Estradiol, Progesterone…… 

– Nguyên lý sandwich: dùng cho việc phân tích những chất có kích thước lớn hơn như: TSH, FSH, LH, βhCG, insullin, C-peptid, Ferritin, troponin T, HBsAg, PSA, AFP, CEA, CA125, CA19-9, CA15-3, CA72-4……

– Nguyên lý bắc cầu: dùng cho việc phát hiện những kháng thể trong mẫu thử như: IgG, IgM, IgA……

Th.s Lương Thị Thu Trang

                                                                           BS Lê Thị Tiến

Trung tâm Huyết học truyền máu

The same category

    Chuyên mục: Kiến thức

    Related Articles

    Trả lời

    Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *

    Check Also
    Close
    Back to top button